ATB-2600-C体内体外美白祛斑功效研究
Research on Skin Whitening Effect of ATB-2600-C
北京大学医学部，北京耐确生化技术研究所，刘毅，100083，010-82894488
中国天津天狮集团有限公司日化部，吴巧玲，301700，022-82137328
摘 要 本文主要论述ATB-2600-C体内体外的美白祛斑功效
Abstract： To investigate the effect of ATB-2600-C on melanogensis in vitro and in vivo.
Key words： Whitening Melanin Tyrosinase Melanocyte
在世界各地，尤其是在亚洲60％的日本女性和75％的中国女性，都希望自己的表皮肤色白里透红。一个人的肤色，与多种因素有关，如皮肤的折光性、毛细血管的分布、血液流量等，但最主要的是决定于皮肤内的色素物质。色素物质位于人体表皮基部的色素细胞（melanocyte, MC）上，在显微镜下观察，色素是一些细小的褐色颗粒。
色素分布愈多愈密，则人体肤色就会愈深愈重；相反色素分布愈少愈稀，则人体肤色就会愈白愈淡。据统计，不同肤色人种的色素细胞量是不同的，在每1平方毫米内，白色人种的色素细胞约在1000个以下，黄色人种则在1300个左右，而黑色人种则超过了1400个。
所以说，皮肤颜色最主要由表皮中黑色素细胞多少和黑色素合成（Melanogenesis）快慢所决定。黑色素（melanin,也译为黑素）是一种生物多聚体（biopolymers），没有固定的分子量，它广泛存在于动物和人的皮肤，眼睛和毛发中。黑色素合成发生在黑色素细胞中，这是来自神经脊的细胞。黑色素细胞合成黑色素的特定细胞器是黑素体（melanosome,MS），正常人表皮黑色素细胞既合成棕色素（eumelanin，也译为真黑色素，或优黑色）,也合成褐色素（pheomelanin，也译为红黄色素，或脱黑色素，）以皮肤色素为例：成黑素细胞(melanoblast,MB)从胚胎起源地——神经脊迁移到特定靶点——主要分散在表皮基底层角质细胞（Keratinocyte, KC）之间和毛囊。表皮黑素细胞形态细长而且扁平，并向周围的KC间伸出细长的树状胞突，黑素细胞这种形态特征有助于黑素小体向周围KC转移，使黑素能均匀分布于表皮基底层上方，以保护基底层的生发细胞（germinative cells）免遭紫外线（UVR）的伤害。
每一个MC通常与大约33-40个KC发生联系，共同组成表皮黑素单元（epidermal melanin unit, EMU），也就是说，一个MC产生黑色输送到其周围30-40个KC中，使皮肤产生颜色。尽管在人皮肤不同区域MC密度差异很大，但细胞总数相对稳定，甚至在不同人种也是如此，平均密度为1000～2000MC/cm2皮肤，基本不受种族、年龄和躯体部位的影响。在一些哺乳动物，MC在真皮内也能发现。真皮MC与表皮MC不同，真皮MC不分泌色素颗粒，推测真皮黑素细胞在保护皮肤免遭UVR损伤中可能不起作用。但真皮黑素细胞通过干扰光线折射也可能影响皮肤颜色。黑色素细胞经过延伸形成树突，经树突顶部，提供成熟的黑素体，进入角质细胞(KC),进一步生成皮肤黑色素。
黑素小体（MS）分四个阶段成长为黑色素：第一阶段黑素小体为圆形，直径约0.3μm，酪氨酸酶活性强，沿细丝集中，小体内不含黑素。第二阶段黑素小体呈椭圆形，长约0.5μm，含有交替排列的纵形细丝，胞膜和细丝均有酶活性，有少量黑素沉积。第三阶段黑素小体中酪氨酸酶活性减弱，部分是通过非酶性的聚合作用显示黑素不断沉积。第四阶段黑素小体中酪氨酸酶活性消失，全部通过非酶性聚合作用形成黑素，并充满整个小体。
人是环境的产物，人种肤色随环境而变化，从细胞水平来说，是随皮肤内部色素量的变化，而色素量的变化，又是对外界光照强烈程度长期适应的结果。可以说人体肤色是自然界在人体上打下的烙印。在地球上不同人种肤色的分布，人体色素深浅变化的趋势，基本是与阳光辐射强弱程度相对应的。色素多、肤色深的人多集中在阳光充足的地球赤道附近。随着地球纬度的推移，离赤道愈远，阳光愈弱，则人体的肤色也就愈浅愈淡。在亚洲，南亚人的肤色比北亚人的肤色要深；在欧洲也是这样，南欧人的肤色比北欧人的肤色也要深。中国药妆美容网 www.yzmr.com 药妆 美容 化妆品
目前认为除了黑素细胞以及EMU的结构和功能外，以下6个独立且关联的过程与皮肤着色（pigmentation）密切相关：1.成黑素细胞（MB）自神经嵴迁徙；2.MB分化成黑素细胞；3.黑素小体的形成；4.黑素合成；5.黑素颗粒自黑素细胞向角朊细胞转移；6.黑素颗粒在角朊细胞内降解。
总之，黑色素的形成经过一系列复杂生理生化过程，目前研发美白祛斑化妆品，主要是通过抑制酪氨酸酶的活性，来减轻皮肤的色素沉着，达到美白祛斑的功效。
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本文采用鼠B16黑素细胞为受试细胞，以氢醌，熊果苷比较，研究ATB-2600-C对黑色细胞的增殖效果，抑制酪氨酸酶活性，以及抑制黑色素生成量的影响相关性。并制成3.5％的霜剂做了100例美白祛斑观察试验, 评价了其安全性和功效作用。
第一部分
(a) B16黑素细胞的培养: B16黑素细胞处于37℃，空气中含5％CO2的环境中,以10％下BS为培养液，每2天传代1次。
(b) 测定细胞酪氨酸酶活性:以左旋多巴为催化底物,采用Marlinez-Esparza等改良方法测定。经药物作用4d后，弃去上清液，用PH7.0的PBS洗涤3次，每次经1000r/m离心5min,每孔加1％Troton X-100溶液90μl，溶解细胞。再经37℃预温后每孔加入1％左旋多巴10μl，37℃孵育30min,于475nm波长处测吸光度，以空白孔调零，在37℃下一小时内每隔10min读各孔吸光度A值。
酪氨酸酶活性抑制率＝（1－A各浓度平均吸光值/A对照组平均吸光值）×100％
(c) 测定黑素细胞增殖活性 : 将B16 黑素细胞以3×104密度置入在12孔板中, 第2天换液,分别加入不同浓度药液，对照组用0.05％（v/v）DMSO处理，在孵化终点，采集细胞,以锥蓝染色，并用血球计数器计数（number of live cells was counted with a hemocytometer）。
黑素细胞增殖抑制率=(1－N各浓度组计数/ N对照组值计数)×100 ％
(d) 测定黑色素含量: 黑色素含量测定采用Hosoi等改良方法。B16黑素细胞以1×105密度培养在6孔板中，经24h后换液，添加不同浓度的药物，72h后,经PBS洗涤两次，样品经空气干燥,溶于200μl 1N NAOH (含1％DMSO) 。经加热80℃至1h后冷却，选择475nm波长在酶联免疫检测仪上读取吸光度值。
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黑色素含量抑制率＝[ 1－（药物孔吸光度值/药物孔细胞密度）/ (对照孔吸光度值 / 对照孔细胞密度)]×100％
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（e）统计分析 全部数值均以X +S 表示。并采用SPSS医用统计软件进行单因素方差分析。
ATB-2600-C与氢醌、熊果苷对酪氨酸酶抑制率％
0.1 0.5 1.5 3.5
ATB-2600-C 26.5 38.6 56.0 89.5
氢醌 15.5 27.6 30.5 80.5
熊果苷 10.5 18.5 25.5 70.6
ATB-2600-C与氢醌、熊果苷对黑素细胞增殖抑制率％
药物浓度％
组别 0.1 0.5 1.5 3.5
ATB-2600-C 8.5 30.8 50.5 85.5
氢醌 26.8 41.5 52.6 99.5
熊果苷 8.9 20.1 38.8 80.5
ATB-2600-C与氢醌和熊果苷对黑素细胞合成的抑制率 ％
％ 0.1 0.5 1.5 3.5
ATB-2600-C 15.5 33.5 60.8 88.9
氢醌 7.5 18.5 36.9 78.5
熊果苷 6.5 15.6 28.9 69.6
第二部分
人体试验，采用自我评估（self-assessment）。所用美白祛斑霜（主要活性成分3.5％ATB-2600C, 0.5％CY-1100）。对照组采用其基质。受试组80人；对照组20人，均为女性。
Human study:self-assessment
2 Weeks 4Weeks
Scale Wording ATB-2600-C Vehicle ATB-2600-C Vehicle
+2 Lighter 20 0 48 0
+1 slightly lighter 55 1 30 2
0 No change 5 19 2 18
-1 slightly darker 0 0 0 0
-2 Darker 0 0 0 0
以上研究证明了：ATB-2600-C是一种安全有效的新型皮肤美白剂，它能抑制酪氨酸酶活性，并且经推测：可能是通过抑制新色素颗粒从黑色细胞向角质细胞转移，减轻角质细胞降解色素颗粒的负载，从而达到美白的功效，值得化妆品配方工程师研制美白新产品所采用。
