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对各种类型受试皮肤表皮提取的黑素体进行分析表明，球状黑素体的含量均低于10％。这说明对于人类皮肤，即使是最浅色的欧洲人的皮肤，褐黑素都是相对次要的表皮黑素成份．另外，随着皮肤颜色加深，黑素体的大小逐渐变大，依次为欧洲人，中国人，墨西哥人，印度人和非洲人。基于以上发现，我们推断，表皮中黑色素的含量和组成强烈地影响着皮肤的着色程度。黑素体的大小变化也是不容忽视的影响因素．数据还表明，人类皮肤在固有色素沉着以及可变色素沉着的机理方面存在细微差异．
关键词：真黑素 褐黑素 黑素体 色度仪 色素沉着 肤色
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引 言
近年来，人类皮肤颜色变化的生物学依据一直是众多研究者探讨的课题。众所周知，光照条件以及皮肤表面形态分布的变化会对肤色产生影响，但是，这些影响往往受环境限制，并且大多是暂时性的，皮肤的生物色素沉着才是决定不同肤色差异的根本因素。换言之，不同种族肤色差异主要取决于表皮黑色素的数量，聚集形式以及分布状况的区别[1]。然而，文献报道：不同人种皮肤中合成黑素细胞的色素密度大致相同(约1000／mm2)[2，3]。在较深色皮肤中所观察到的较多的黑色素应该缘于深肤色人种细胞中参与合成黑色素的酪氨酸酶的高活性[4.5]。黑色素是由多种色素组成的混合物，其中包括淡黄色或红色的褐黑素，淡褐色的DHICA(5,6二羟基吲哚羧酸)富集着的真黑素以及深褐色或黑色的DHI(5,6二羟基吲哚)富集的真黑素[6]，这些成份比例随人种和皮肤光暴露程度不同而变化，即深色皮肤含更多的深色黑素色粒[6-10]。但是，目前对于
黑素成份变化对人类皮肤颜色的影响的研究还相当少．
黑色素在微观结构上的聚集形式和分布也随着人种的不同而不同．深色人种皮肤中，黑素形成较独立且分散的大黑素体(约1μM)，而浅色人种皮肤中黑素体尺寸较小(约0.5μM)[11,12]，在表皮中由隔膜分成不同的”簇”．这些分布模式似乎取决于黑素体粒子的大小[13]，但是，目前尚不清楚它们对肤色影响程度有多大．
此项研究旨在测定不同种族的皮肤在光暴露和光保护状态下的黑素含量和组成．结果表明黑素的数量和组成对于控制人体皮肤固有色素沉着均有重要作用。然而，固有色素沉着和相关的存在于长期光暴露皮肤中的慢性UV光诱导过度色素沉着的机理随种族差别而呈现细微差异．
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实 验 部 分
皮肤来源
本研究中涉及的受试者的征集以及活组织取得工作是在南非MEDIJNSA药剂学校以及美国亚利桑那洲ARGUS实验室进行的。研究过程开始之前已得到相应的伦理许可，在参加测试之前，所有受试者均表示同意参与此项研究．
受试者来自以下民族和国家：居住在南非的欧洲人(即下文中所指欧洲人，共10人)和中国人(共8人)，美国的墨西哥人(下文所指墨西哥人，共l0人)，居住在南非的印度人(印度次大陆人的后裔，共10人)以及南非黑人(下文所指非洲人，共10人)。实验中采用CR10色度仪(MINOLTA，除镜)进行三色(L*a*b*)值测定．测试部位分别位于手前臂外侧距肘2英寸处(即光暴露部位)和手上臂内侧距肘2英寸处(即光保护部位)，每次测试均读数三次，取平均值作为计算和统计之数据．
随后，由合格的医师分别在受试者两处测试点的周围取得3…4个
4mm大小的活组织切片(每位受试者约得6-8个切片)，取样点尽可能接近色度仪测定点。取样时，先用消毒酒精纱布清洁皮肤，后用l％或2％塞罗卡因对取样点施以麻醉(加／不加肾上腺素)，然后使用消毒活体切片打孔机和消毒剪刀在设定点取出直径4mm，厚2mm的活体切片．医师根据需要对伤口进行缝合或敷料处理。每一测试点获取的切片中选一枚进行组织学分析，剩下的所有切片立即保存于-700C干冰中待用．
表皮黑素含量分析妆，药妆网 中国药妆 中国药妆美容网 www.yzmr.com
本实验采用Ozeki等人提出的方法[14]对表皮中浅色，碱溶性黑素和深色，非碱溶性黑素进行含量测定。首先将活体切片在2MNaBr的PBS溶液中室温下浸泡4小时，进行表皮与真皮分离。然后将表皮置于真空中用：P2O5干燥72小时以上，称量干燥样品精确至6位小数．然后放进25μl蒸馏水中用玻璃均质器均质，而后将均质液转移，冲洗，得500μ1混合物．混合物离心后去除上层液体(转速13,000rpm)。小球状的表皮均质物放于1M NaOH／8M尿素溶液(200μ1)中，搅拌30分钟，用针将球体分离，再把混合物置于温控搅拌器中常温下剧烈搅拌30分钟。离心(13,000rpm)10分钟，将上层液转移，制成500μ1液体。剩下的球体留待非碱溶性黑素成份分析。上层液体与200μl氯仿混合搅拌，离心10分钟(13,000rpm)以分离其中的蛋白质和脂肪。取175μl液体相转移到新容器离心10分钟(13,000rpm)。取150μ1上层液体至微滴定盘中，在340nm处测定其光学密度。将实验中得到的非碱溶性球状物倒入lMNaOH200μl中，在600C下封闭中速搅拌96小时．按前述方法用氯仿对混合物分离，在340nm测定所得液体的光学密度。测得数据按照干燥表皮重量换算。将人造黑素(Sigma,M-8631)制成溶液，在370C或600C下制作光学密度标准曲线，估算测试样品碱溶性和非碱溶性物质中的黑素含量．总黑素含量即为二者的加和．
黑素体的形态及大小分析
从人体表皮中提取黑素体，参照Alaluf等人提出的方法(6)，采用电子显微镜计算机辅助影像分析系统对其进行形态和尺寸确定。结果发现：球状黑素体是一种长短轴比例在1．25—1．35之间的椭球，并确定了它们在总黑素体中的含量。另外，通过对黑素体平均像素面积的计算，确定黑素体的尺寸大小．
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结 论
采用CR10色度仪分别对欧洲，中国，墨西哥，印度以及非洲受试者的手臂内侧(光保护皮肤部分)和手臂外侧(长期光暴露部分)进行反射系数测定．总反射系数(三色L*值)用来说明不同种族皮肤在固有和可变色素沉着方面的根本差异(图1)．肤色最浅的是欧洲人，其L*值最高，然后是中国人和墨西哥人，L*值次之，但两数值间并没有统计上的差异．印度人肤色明显比欧洲人，中国人以及墨西哥人深，非洲人肤色最深(t检验，p<0.05)．另外，光暴露皮肤的L*值与光保护皮肤相比，存在统计上的显著性差异，△L*}对于所以受试者均在10-11个单位左右。(成对t检验，
p<0.001)，这说明，无论何种种族，其处于光暴露状态的手臂外侧都比处于光保护状态的手臂内侧的肤色深。不同种族皮肤表皮黑素含量差异。
有文献报道：在对一类毛皮颜色变异的鼠科动物的实验中，依据其不同的碱溶解性，成功地将浅色的褐黑素和富含DHICA的真黑素与深色的富含DHI的真黑素分离开(14)。借鉴这种方法，我们分析了人体皮肤表皮中黑素的含量和组成．
从不同人种的长期光暴露和光保护的皮肤中提取的表皮黑色素被分离成两部分：碱溶性部分和非碱溶性部分。碱溶性成份中浅色的褐黑素以及DHICA富集的真黑素的含量通过HPI。C分析测定(数据未列出)．每份样品中碱溶性和非碱溶黑素成份则由光谱分析方法定量．总黑素含量即为两部分的加和(图2)．
通过比较手臂内侧和外侧表皮中碱溶和非碱溶成份含量发现：光暴露皮肤中二者的含量均比光保护皮肤中高约1.3-2.0倍(成对t检验；p<0.01)。不同种族皮肤比较说明：随着肤色变深，其表皮中碱溶性黑色素的含量明显降低(图2a)．但印度人皮肤中碱溶性黑色素的浓度却明显高于中国人和墨西哥人(t检验，p<0.05)，这是一个特例。非洲人皮肤中含浅色黑素成份最低．妆，药妆网 中国药妆 中国药妆美容网 www.yzmr.com
非碱溶性黑素在不同种族皮肤中的含量呈现另一种趋势(图2b)：肤色最深的非洲人和印度人的皮肤中这种黑素的含量大概是浅色人种即中国人，墨西哥人以及欧洲人的2倍多(t检验；p<O．001)，非洲人和印度人在此方面没有显著差异．但是，墨西哥人的皮肤中所含非碱溶黑素的量明显比欧洲人高。(t检验；p<O．005)将碱溶性和非碱溶性黑素含量相加即为表皮中总黑素含量．由图表可知(图2c)：非洲人和印度人表皮黑素含量最高，二者问没有明显差异(t检验；p<O．001)。浅色皮肤人种之间，表皮总黑素含量也没有明显差异。另外，最浅色皮肤的欧洲人与最深色皮肤的非洲人相比，其表皮总黑素含量仅差别2倍。这与文献所述不同种族皮肤酪氨酸酶活性以及黑素含量的比较结果(2．3倍)是一致的[4,15]．
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不同种族间表皮黑素成份差异
根据测定的碱溶性和非碱溶性黑素含量数值，计算二者对总黑素量的贡献值，结果见图3．图中列出了碱溶性黑素占总量的百分比．(图3)
通过分析五种种族受试者光暴露部位和光保护部位皮肤的黑素组成可以发现一个相当明显的统计趋势(图3)：随着肤色由深变浅，即从非洲人到欧洲人，其表皮黑素中碱溶性黑素含量逐渐增加。(t检验t；p<O．05)，这与以往的研究结果是一致的【o。…。同样，比较各种族受试者光暴露部位与光保护部位皮肤的碱溶性黑素含量可以发现，多数受试皮肤呈现后者多于前者的趋势。与以前的研究结果一致【6】，但是，这种差别比种族间表现出的碱溶性黑素含量差异小得多．
不同种族表皮褐黑素含量差异
在以前的研究中我们曾经提到：通过确定从人体皮肤中分离的一定量黑素体中球状黑素体的浓度可以估计出表皮中褐黑素的含量【6】。采用类似的方法，我们分别估算了五种人种受试者光暴露部位和光保护部位表皮的褐黑素含量．图中显示的数据是球状黑素体占总黑素体的百分比．(图4)数据分析的结果与我们以往的研究发现相类似16】。总的来说，球状黑素体更多地富集在受试者光保护部位的皮肤里，但中国人是个例外。然而，和其他类似的研究者一样，我们发现，无论对于同一种族还是在种族之间，数据的离散度都比较大H粤J。因此，鉴于每组受试者的数量
较少，可以认为，对每个种族受试组来说，光保护部位皮肤球状黑素体的相对富集不具有统计意义(图4)．但是，如果把所有受试者的数据汇集在一起，即对于整个受试人群来说，球状黑素体在人体光保护部位与光暴露部位的浓度差异是有统计意义的。(成对t检验：p<0.02；n=45)(图4)．
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不同种族表皮黑素体的大小差异
本文实验部分描述了受试者表皮黑素体平均大小的测定方法．测试数据显示出两个明显趋势：对所有种族受试组来说，光暴露部位表皮黑素体相对较大．但是，由于存在较高的数据离散度，这种差异仅仅在印度受试组中具有统计意义(图5)．同样，当我们汇集所有受试数据又发现：对整个受试人群来说，黑素体大小在光暴露和光保护部位的差异(约1．1倍)具有非常明显的统计意义。(成对t检验：p<0.001；n=45)(图．5)．另一个显著趋势是：随着种族肤色变深，即从欧洲人到非洲人，平均黑素体大小呈现统计性增长(图5)。在我们以往对欧洲人和非洲人皮肤的研究中也曾发现了这一现象[11,12]，但是本文中对于一系列种族人群的皮肤，论述其表皮黑素体大小的统计性变化尚属首次。目前尚不清楚黑素细胞中不同大小的黑素体是如何被形成的，但是我们发现，表皮黑素总量与黑素体大小之间存在较好的相关性(r=0.62，．p<0.000l；n=45)，这说明，皮肤中总黑素量在一定程度上影响着黑素体的大小．
讨 论
研究结果表明：不同种族人群之间的确存在着表皮黑素总量和组成上的差异。深度色素沉着的皮肤比轻微色素沉着的皮肤总黑素含量高．而在后者中含更多的浅色碱溶性黑素，如褐黑素和DHICA富集的真黑素。对于同一受试者来说，其光暴露部位和光保护部位表皮的总黑素含量也存在明显差异，这与我们以往的研究结果相一致[6]．尽管最浅和最深肤色种族间表皮总黑素含量差别(约2倍)与个体光暴露部位和光保护部位表皮总黑素含量差别(约1.5-2.0倍)(图2)相差不大，但相应的表皮黑素成份差别却相去甚远，人种间差别约3倍，个体不同部位差别约为1.2-1.3倍(图3)。众所周知，种族间表皮黑素细胞的数量几乎相同，那么，可以解释为：不同类型皮肤中黑素总量和成份的差异是由其中的酪氨酸酶的活性差别造成的[4,5]．我们以往的研究发现：长期处于光暴露状态的人体皮肤，其黑素细胞的数量约为光保护状态皮肤的2倍[16-18]。这一数据正好解释了长期光暴露皮肤高度色素沉着的显著特征。同时还说明，在这类皮肤中，黑素总量明显增多(2倍左右)，而黑素组成成份却不会受到影响发生变化。这正是我们在实验中所得到的结果(图3)。另外，也证明了固有色素沉着与可变色素沉着在机理上的本质差异．在另一个独立的实验中，我们分析了从人体不同部位皮肤中提取的球状黑素体，结果表明光保护部位表皮褐黑素的含量相对较高(图4)，这与前述的黑素可变溶解实验的结果(图3)以及以往的研究一致[6-8]．同时也暗示了在长期UV光暴露下，不同种族皮肤均存在着自我保护的适应能力。虽然数据并不存在着统计性差异，但仍可发现在固有色素沉着发生的部位(光保护部位)，浅色皮肤人种(欧洲人，中国人和墨西哥人)表皮中球状黑素体所占的比例比深色皮肤人种(印度人和非洲人)高，假设酪氨酸酶的活性是关键因素，那么，酶活性越高，形成具有光保护功能的真黑素的趋势就越高于褐黑素[19,20]。
另一个值得注意的发现是：褐黑素在表皮总黑素中的含量相当低，即使对于最浅肤色人种欧洲人，其褐黑素占总黑素的比例也不到10％。(由于测试人种的限制，这项结论并不代表I型皮肤)。我们发现，这一结果与Ito等人提出的”外套模型”的假设相一致。这个模型提出：在酪氨酸酶的活性足以保证真黑素生成的情况下，控制褐黑素合成的因素是半胱氨酸而不是多巴醌[21]．实验结果证明：即使最浅肤色人种(欧洲人)，其皮肤中仍然存在真黑素(图2)．因此，尽管种族之间存在较大的表皮酪氨酸酶活性和黑素含量的差异，我们仍可以设想，由于半胱氨酸的生物利用率有限，褐黑素的浓度会迅速达到饱和。我们在实验中得到的结论证实了这个假设的真实性．
对黑素体形态的分析研究有助于我们确定实验中从各类人种皮肤的不同部位提取的黑素体的大小变化。分析表明，随着肤色加深，受试者表皮黑素体的尺寸逐渐增大(图5)．黑素体大小与总黑素含量有关(r=0.62)，但从相关系数上看，黑素细胞内部，仍然存在着其他影响黑素体大小的因素。实验结果表明：不同种族间固有色素沉着部位黑素体大小的差异(1.2-1.5倍)比个体不同身体部位(光暴露部位与光保护部位)黑素体大小的差异(约1．1倍)(图5)要大．这同样反映了人体皮肤中固有色素沉着与可变色素沉着在生物帆理方面的差异。目前，黑素体大小对肤色的影响作用还不清楚。已知在入体皮映中，体积大的黑素体倾向于单个粒子分布，而小的黑素体则聚结成簇[13]。如果黑素体分布方式的确与其粒子大小有关。我们可以推测，表皮中单独分布的粒子越多，则其中所含的大体积黑素体越多．假设两种皮肤分别含有等量的小黑素体簇和大黑素体，则含大黑素体的皮肤应具有较高的结合光的能力从而吸收更多的入射光，使表面反射系数(L*值)降低。相应地，其皮肤肤色也较深．这个推断很好地解释了为什么印度人和非洲人在固有色素沉着部位测得的黑素总量相近(图5)，而L*值却存在明显差异(图1)．
总而言之，表皮总黑素含量，黑素组成以及黑素体的大小都是影响人体肤色的重要因素。由于皮肤中各种颜色黑素成份对肤色的贡献不同，造成最终黑素沉着的肤色有所不同。因此，肤色较浅，既说明皮肤中黑素含量较低，也说明黑素中含更多的浅色素成份。此外，黑素的分布方式，是单个粒子还是成簇分布，也影响着最终的肤色结果。不同种族间皮肤黑素成份和黑素体大小的显著差异说明：这二者在确定人体固有色素沉着的种族差异方面尤其重要．相比而言，个体受试者光暴露和光保护部位在黑素成份及黑素体大小方面差别较小，说明总黑素量是决定这两个部位肤色差别的重要因素．
在以后的研究中，将定量地来分析黑素含量，组成以及黑素体大小对受试者皮肤L*a*b*值的影响。从而更深入了解这些生物成份的重要性． |
